Malignes Melanom: Next Generation Sequencing hält Einzug in die Routinediagnostik

Dr. Sylvia Bochum

Interessenkonflikte

4. November 2014

Dr. Roland Penzel

Frankfurt Neue Möglichkeiten der molekularen Diagnostik in Kombination mit zielgerichteten Therapien haben in der Melanomtherapie in den letzten Jahren einen Paradigmenwechsel eingeläutet. Mittlerweile ist der Nachweis spezifischer Mutationen in Genen wie BRAF und cKIT beim malignen Melanom Teil der Routinediagnostik.

Das Spektrum therapeutisch relevanter genetischer Alterationen erweitert sich jedoch stetig. „Dadurch gelangen die momentan gängigen Methoden zur Mutationsanalyse an ihre technischen Grenzen“, erklärte Dr. Roland Penzel vom Pathologischen Institut des Universitätsklinikums Heidelberg kürzlich bei der Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Dermatologische Onkologie (ADO) in Frankfurt [1]. Die Etablierung eines fokussierten Next Generation Sequencing (NGS) sei nun der nächste Entwicklungsschritt.

Vemurafenib auch bei selteneren BRAF-Mutationen wirksam

Bei jedem zweiten Patienten mit einem kutanen malignen Melanom lässt sich im Tumor eine BRAF-Mutation nachweisen. Diese führt zu einer dauerhaften Aktivierung der dem RAS-RAF-MEK-ERK-Signalweg nachgeschalteten Signalkaskaden und trägt so entscheidend zur Entwicklung und Progression des Melanoms bei.

 
Zukünftig sollten in der Routinediagnostik deshalb auf jeden Fall auch die selteneren BRAF-Mutationen mitgetestet werden. Prof. Dr. Lucie Heinzerling
 

In der Mehrzahl der Fälle findet sich eine V600E-Mutation, bei der an Position 600 des BRAF-Proteins die Aminosäure Valin gegen Glutamat (V600E) ausgetauscht wurde. „Aber auch andere BRAF-Mutationen wie beispielsweise V600K und V600R sind nicht so selten wie ursprünglich angenommen”, berichtete Prof. Dr. Lucie Heinzerling, Oberärztin an der Hautklinik des Universitätsklinikums Erlangen, ebenfalls bei der ADO-Tagung [2]. Diese anderen Mutationen könnten mittlerweile in bis zu 30% der BRAF-mutierten Melanome nachgewiesen werden.

Der Kinaseinhibitor Vemurafenib hemmt selektiv die mutierte BRAF-V600-Kinase. Unter dieser Therapie verlängert sich das progressionsfreie Überleben der Patienten mit einem metastasierten Melanom im Vergleich zur Chemotherapie um das 3-fache. Kürzlich wurde gezeigt, dass die BRAF-Inhibition mit Vemurafenib aber nicht nur bei der häufigen V600E-, sondern zumindest auch der V600K-Mutation wirksam ist. „Zukünftig sollten in der Routinediagnostik deshalb auf jeden Fall auch die selteneren BRAF-Mutationen mitgetestet werden“, so Heinzerling.

 
Beim malignen Melanom müssen wir jetzt bei der Mutationsanalyse deshalb methodisch umstellen. Dr. Roland Penzel
 

Sequenzielle Mutationssuche sehr zeitaufwendig

Momentan sind die Nachweismethoden für BRAF-Mutationen je nach Zentrum sehr unterschiedlich. Weit verbreitet ist die Testung mit dem von Roche Diagnostics entwickelten Real-Time-PCR-Test Cobas 4800 BRAF V600. Dieser kam bereits bei den Zulassungsstudien für Vemurafenib zum Einsatz und detektiert eine BRAFV600E-Mutation mit hoher Sensitivität.

Die Nachweisrate von Nicht-V600E-BRAF-Mutationen oder von V600E-Mutationen, die durch eine 2-bp-Mutation entstehen, ist jedoch limitiert. „Damit fällt leider ein beträchtlicher Teil der Patienten, die von einer Therapie mit Vemurafenib profitieren könnten, durchs Raster“, so Penzel.

Eine alternative Methode, mit der sich deutlich mehr Mutationen erfassen lassen, ist die Sanger Sequenzierung. Mit dieser können Punktmutationen in einem vorgegebenen, ca. 500–700 Nukleotide umfassenden DNA-Abschnitt nachgewiesen werden. Allerdings liegt die Sensitivitätsrate bei 20%, d. h. mindestens ein Fünftel des analysierten Materials muss mutierte Tumor-DNA enthalten. „Die Sanger-Sequenzierung ist zudem sehr zeitaufwendig“, so Penzel.

Für die BRAF V600-Analyse müsse man vom Materialeingang bis zum Befundausgang 3 Werktage rechnen. Finden sich im BRAF-Gen keine Mutationen, wird die Analyse von cKIT sowie NRAS angeschlossen. Denn aktivierende cKIT-Mutatio­nen, die sich ebenfalls zielgerichtet therapieren lassen, liegen bei ca. 1 bis 2% der Melanom­patienten vor. NRAS-Mutationen finden sich sogar bei etwa 15 bis 20% aller Melanome. „Für dieses sequenzielle Vorgehen in der Mutationsanalyse muss man insgesamt sogar sieben Werktage einplanen“, so Penzel.

NGS-Analytik erfasst alle relevanten genomischen Veränderungen

 
Man darf nicht alles glauben, was die Analyse-Algorithmen auswerfen. Dr. Roland Penzel
 

In Zukunft sei es jedoch wichtig, nicht nur Punktmutationen und kleine Deletionen und Insertionen zu detektieren, sondern beispielsweise auch Amplifikationen und andere genomische Rearrangements, so Penzel. Hier gelange selbst die Sanger Sequenzierung technisch an ihre Grenzen. „Beim malignen Melanom müssen wir jetzt bei der Mutationsanalyse deshalb methodisch umstellen“, so Penzel. Er erläuterte in Frankfurt, was bei der Nutzung des Next Generation Sequencing (NGS) in der Praxis beachtet werden sollte.

„Die NGS-Analytik hat den Vorteil, dass sie die Detektion aller relevanten genomischen Veränderungen mit nur einer technologischen Plattform ermöglicht“, so Penzel. Am Pathologischen Institut des Universitätsklinikums Heidelberg sei der methodische Wechsel bereits in die Wege geleitet. „Der Workflow ist beim NGS allerdings nochmals dramatisch komplexer als bei der Sanger-Sequenzierung“, gibt Penzel zu bedenken.

Allein die Prozessierung der Proben benötige 4 Werktage, die bioinformatische Daten-Analyse einen weiteren Werktag. Überhaupt stelle die Interpretation der Befunde bei dieser Methode eine große Herausforderung dar. „Man darf nicht alles glauben, was die Analyse-Algorithmen auswerfen“, bringt Penzel die Problematik auf den Punkt. Hier sei auch die entsprechende bioinformatische Expertise erforderlich.

Dennoch sei das NGS zweifellos das Verfahren der Zukunft. „Die Methodik ist in der molekular-pathologischen Routinediagnostik problemlos einsetzbar“, so Penzel, denn auch Formalin-fixiertes und in Paraffin eingebettetes (FFPE) Material lasse sich auf diese Weise untersuchen, ohne dass die Ausfallrate dramatisch ansteige.

Momentan setzt Penzel in Heidelberg beim malignen Melanom ein kommerzielles Tumor-Panel ein, das Cancer Hotspot Panel der Firma Ion Torrent, das 207 Amplikons umfasst und neben BRAF, NRAS auch zahlreiche andere, an der Tumorgenese beteiligte Gene analysiert. Allerdings entwickelt das Melanoma-Network aktuell auch ein Melanom-spezifisches NGS-Tumor-Panel, mit dessen Markteinführung im Frühjahr 2015 zu rechnen ist.

 

REFERENZEN:

  1. 1. 24. Deutscher Hautkrebskongress / Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Dermatologische Onkologie (ADO), 11. - 13. Sept. 2014, Frankfurt a. M.

 

Kommentar

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